对于难以治愈的慢性糖尿病伤口，氧化应激和长期轻度炎症是影响伤口愈合的关键性因素。与正常伤口愈合过程不同，慢性糖尿病伤口通常延长或停滞在炎症阶段。过量自由基（包括活性氧（ROS）和活性氮（RNS））引发的氧化应激导致损伤修复早期增强炎症反应、后期引起氧损伤抑制细胞行为和组织再生。因此，清除过量ROS/RNS是加速慢性糖尿病创面修复的有效策略之一。由于抗氧化酶的功能降低，糖尿病微环境中ROS和抗氧化剂之间的平衡被打破。近年来，以氧化铁、二氧化铈、氧化锰等为代表的无机纳米酶，由于其类酶催化功能，广泛用于调节ROS水平。与无机纳米酶的潜在生物毒性和不可降解性相比，天然多酚（例如:单宁酸、没食子酸、茶多酚等）由于酚羟基的自由基清除特性被认为是良好的生物相容性抗氧化剂和抗炎剂。然而，酚羟基的稳定性使得这些分子催化效率不高且难以实现可持续的抗氧化过程。将小分子多酚类化合物嵌入生物金属有机骨架（bio-MOF）中是提高催化效率和生物利用度的一种有效途径。直接引入抗氧化剂小分子作为MOF的配体并通过体内降解释放它们避免了在通过MOF孔径负载的药物递送期间由非活性配体的降解引起的额外的毒副作用。同时，生物活性金属离子被用作中心离子，以赋予bio-MOF更多的生物效应。然而，bio-MOF在水中的不稳定性是限制其发展的关键因素。稳定的MOF结构具有更广泛的应用潜力。

针对上述问题，武汉理工大学戴红莲教授，提出了一种通过没食子酸-镁金属有机框架（Mg-GA MOF）持续调节氧化应激微环境的策略，并基于海藻酸钠（SA）/壳聚糖季铵盐（HACC）开发了可喷涂水凝胶敷料来治疗糖尿病伤口。壳聚糖季铵盐具有抗菌性能，可预防创面细菌感染。具有类酶催化功能的Mg-GA MOF在早期快速清除活性氧并加速M1型巨噬细胞向M2型的极化。修复后期维持氧化还原平衡并通过镁离子辅助治疗促进血管再生和神经元形成。可喷涂水凝胶敷料通过调节氧化应激水平，促进神经血管网络重建，加速上皮再生和胶原蛋白沉积，快速修复糖尿病伤口。该成果于2024年05月01日以《Mg-gallate metal-organic framework-based sprayable hydrogel for continuously regulating oxidative stress microenvironment and promoting neurovascular network reconstruction in diabetic wounds》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.04.028）。

研究示意图

（1）Mg-GA MOF连续释放没食子酸

采用微波辅助合成技术制备没食子酸-镁金属有机骨架（Mg-GA MOF），并在合成过程中加入二甲基甲酰胺（DMF）以优化合成方法。与在高温（>120℃）下需要较长时间（12~24h）的传统水热合成法相比，该方法在相对较短的时间内（30min）快速获得单分散、粒径均匀的Mg-GA MOF。随着DMF浓度从20%增加至80%，Mg-GA MOF形态从双锥形变为立方体，最终为球形。在60% DMF/水体系中，Mg-GA MOF的元素分布均匀，XRD分析显示结构未改变，但衍射强度随DMF浓度增加而降低。热重分析确认了Mg-GA MOF的化学式。微波辅助合成方法相比传统水热法，能快速制备出均匀的Mg-GA MOF，且DMF的存在对结晶度影响较小。DMF的极性增强和水解产物的调节作用加速了反应速率。不同形态的Mg-GA MOF在PBS中降解和GA释放速率不同，60% DMF/水体系下制备的Mg-GA MOF稳定性最高。

图1. Mg-GA金属有机框架(MOF)具有可控的形态，可连续释放没食子酸。A) 不同DMF/水溶剂系统制备的Mg-GA MOF形态和在磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)中降解后的Mg-GA MOF形态的代表性SEM显微照片。B) Mg-GA MOFs的X射线衍射(XRD)图谱。C) 在不同DMF/水系统中制备的Mg-GA MOF在PBS (pH 7.4)中的GA释放曲线。D) 在60% DMF/水系统中合成的Mg-GA MOFs在去离子水、PBS (pH 7.4)和细胞培养基中的释放行为。E) DMF调节晶体形态的机制

（2）Mg-GA MOF清除ROS的酶催化作用

通过检测对硝基四氮唑蓝(NBT)还原的抑制来测定Mg-GA MOF的SOD样活性。结果显示Mg-GA MOF组在560 nm处的低吸收峰，表明Mg-GA MOF的SOD样能力。同时，随着浓度的增加，Mg-GA MOF的类SOD能力明显提高(图2B)。H₂O₂清除率随着Mg-GA MOF浓度的增加而显著增加(图2C)。结果表明，Mg-GA MOF (CMg-GA MOF = 500 μg/mL)孵育后，H₂O₂清除率为42.9 %。Mg-GA MOF具有类似CAT的清除H₂O₂的催化能力，与AA没有显著差异。但反应速率大于Mg-GA MOF中所含相同量的GA，这可能是由于Mg-GA MOF吸附H₂O₂加快了反应速率，或与其表面活性位有关。值得注意的是，Mg-GA MOF的CAT样活性的剂量依赖性小于SOD样活性的剂量依赖性。Mg-GA MOF对•OH的清除能力与GA相似，但低于AA（图2D）。此外，Mg-GA MOF在清除DPPH自由基方面表现出色，其效果优于传统抗氧化剂抗坏血酸（图2E）。总体而言，Mg-GA MOF通过其酶催化能力清除多种活性氧自由基，维持氧化还原平衡，并在清除O2⋅-和H2O2方面显示出潜在优势。同时，Mg-GA MOF在低剂量下能有效清除RNS，避免了过氧亚硝酸盐阴离子（ONOO-）的积累和亚硝化应激。

图2. Mg-GA MOF具有酶催化功能，可以清除ROS。A) Mg-GA MOF清除ROS和RNS的机制。包括B) O2•-，C) H₂O和D) •OH的ROS清除率。E) Mg-GA MOF的DPPH•-清除率

（3）Mg-GA MOF的体外抗炎和抗氧化能力

为了研究Mg-GA MOF是否能降低炎症环境下的氧化应激，我们采用活性氧荧光探针2,7-二氯氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内ROS含量。由图3A和B可以看出，LPS组扁平的煎饼状细胞（M1型）具有较强的绿色荧光，而对照组的ROS含量较少，LPS + Mg-GA MOF处理组转化为长纺锤形细胞（M2型），其ROS+绿色荧光强度明显降低。提示LPS在刺激RAW264.7炎症反应的同时，产生大量细胞内ROS，增加氧化应激水平。Mg-GA MOF通过降低细胞内ROS水平和改善炎症介质来调节巨噬细胞的极化。LPS和Mg-GA MOF处理后的RAW 264.7的SEM图像再次证实了巨噬细胞极化（图3C）。与未处理组比较，Mg-GA MOF处理后，LPS诱导的细胞由立体球形（紫色细胞，M0型）变为扁平薄饼状（蓝色细胞，M1型），再变为长梭形（橙色细胞，M2型）。图3C - G为免疫荧光图像及流式细胞术和半定量分析结果。LPS刺激后，RAW264.7细胞CD86+含量显著增加，表明细胞向M1型分化。随后，Mg-GA MOF孵育后，CD206+细胞含量显著增加，表明RAW264.7细胞由M1向M2极化，由促炎状态向抗炎状态转变。同时，LPS+Mg-GA MOF处理后细胞CD86+/CD206+值显著低于对照组和LPS组。结果表明，Mg-GA MOF能促进RAW264.7细胞M1向M2的极化，并具有体外抗炎活性。为了进一步验证Mg-GA MOF对不同皮肤细胞的保护作用，我们使用活性氧荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平。直接暴露于H2O2而无pro保护的组细胞可见高强度的绿色荧光，证实氧损伤后细胞内ROS水平显著升高（p < 0.0001）。然而，预培养Mg-GA MOF组的荧光强度与对照组相当，表明细胞未被氧损伤（图3H-K）。因此，由于没食子酸的抗氧化作用，Mg-GA MOF在抵抗H2O2攻击和避免细胞氧损伤方面表现出优异的性能。

图3. Mg-GA MOF在体外具有抗炎和抗氧化作用。A) 明场和ROS荧光合并图像以及B) RAW 264.7细胞内ROS荧光强度。标尺：50微米。C) LPS和Mg-GA MOF处理后RAW 264.7的代表性SEM图像和免疫荧光图像，用于CD86+和CD206+（M0型为紫色；M1型为蓝色细胞；M2型为橙色细胞）。D) RAW 264.7流式细胞术结果和E-G) CD86+和CD206+的半定量分析。H-K) Mg-GA MOF保护hUVEC、L929和HaCaT细胞免受氧损伤和细胞内ROS荧光强度分析

（4）Mg-GA MOF增强体外内皮细胞迁移和小管形成

血管生成对组织再生至关重要，依赖于血管内皮细胞的迁移和网络形成。通过划痕实验，发现Mg-GA MOF处理的hUVEC细胞迁移范围大于未处理组，24小时后移动率显著提高。这表明Mg-GA MOF通过释放Mg²⁺促进细胞迁移。此外，管状结构形成实验显示，Mg-GA MOF组的hUVEC细胞在形成管状结构方面优于对照组，3小时后分支数量和长度是对照组的4倍，6小时后效果依然显著。综上所述，Mg-GA MOF能显著促进内皮细胞迁移和管状结构形成，对血管再生具有重要作用。

图4. 镁-甘氨酸MOF的血管生成效应。通过划痕实验评估了镁-甘氨酸MOF对hUVEC细胞迁移A)和细胞移动速率C)的影响，从0到24小时。B) 镁-甘氨酸MOF促进内皮细胞的体外管状结构形成。3小时和6小时处理后的代表性明场图像以及D) 分支数量和F) 管道长度的半定量统计

（5）基于镁-GA MOF的可喷雾抗菌凝胶敷料

水凝胶敷料的溶胶-凝胶转化是通过A溶液和B溶液的相互喷涂实现的，其中A溶液为海藻酸钠（SA）水溶液，B溶液为含有Mg-GA MOF的壳聚糖季铵盐（HACC）钙离子溶液。雾化后的SA和钙离子溶液在大约几十秒内快速交联（图5A-C）。Mg-GA MOF与革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（S. aureus, BNCC 186335）孵育24 h后，CFU实验和半定量结果显示，随着Mg-GA MOF或GA浓度的增加，对金黄色葡萄球菌的抑制作用增强，且Mg-GA MOF对金黄色葡萄球菌的半抑制浓度（IC 50）低于GA（图5D和F）。图5E和G为Gel/MOF、Gel/GA和Gel（不含MOF的水凝胶敷料）孵育24 h后的抑制区和抑菌圈直径。Gel、Gel/GA和Gel/MOF均能抑制金黄色葡萄球菌的生长。凝胶/MOF对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用更强，抑制圈直径为3.66±1.05 mm，明显优于凝胶和凝胶/GA（抑制圈直径分别为1.89±0.12 mm和3.14±0.08 mm）。

图5. 含有Mg-GA MOF的可喷洒水凝胶敷料在细菌抑制方面有效。A) 可喷洒水凝胶敷料的制备示意图。B) 喷涂Gel/MOF水凝胶敷料。C) 水凝胶敷料成型图像。代表性图像D) 显示Mg-GA MOF和GA对S. aureus的抑制作用以及抑制率F)，通过菌落形成单位(CFU)确定。E和G) 抑菌圈测试评估了Gel、Gel/GA和Gel/MOF水凝胶敷料对S. aureus的影响（PBS为不含GA和MOF的Gel，MOF为含MOF的Gel，GA为含GA的Gel）。H) Gel/MOF抗菌效果机制图

（6）可喷雾水凝胶敷料在体内加速糖尿病伤口愈合

在db/db糖尿病小鼠中评估了Gel/MOF对直径为6 mm的全层皮肤缺损的影响（图6A）。如图6B-D所示，术后前3天各组间无明显差异。第4天，凝胶/MOF的创面面积减少到57.95±4.45%。明显小于对照组和凝胶组。8 d后，凝胶处理组创面面积较对照组减少，但与凝胶/MOF组仍有显著差异。H&E染色结果如图6E–F所示。虽然在用凝胶和凝胶/MOF处理后，再生表皮的厚度与对照组没有太大差异，但对照组可以清楚地识别伤口的位置。同时，与凝胶组中的基本伤口愈合相比，凝胶/MOF组中的伤口完全愈合并且几乎与周围的皮肤组织相同，并且可以看到更多的血管、毛囊和皮脂腺。为了评估对上皮再形成的影响，我们在第16天使用K14和K10对组织切片进行染色。与凝胶组相比，用凝胶/MOF处理的组中细胞角蛋白的总量显著增加，并且K10和K14的表皮中的含量分别从80.76 %增加到90.36 %和从59.85 %增加到62.27 %(图6J和K)。值得注意的是，对照组在低K14水平下K10分泌过多，并伴有颗粒层边界不明显，颗粒层和棘层增厚(图6H)。通过Masson染色检测再生组织的胶原沉积(图6E和G)。观察到凝胶和凝胶/MOF组显示出比对照组明显更多的胶原沉积，并且凝胶/MOF组比凝胶组高约1.18倍。通过天狼猩红染色进一步分析胶原沉积的类型(图6I和L)。第16天，对照组胶原呈黄绿色，经凝胶和凝胶/MOF处理后变为橙黄色和鲜红色。

图6. 可喷洒的水凝胶敷料在体内加速了糖尿病伤口愈合。A) 在db/db小鼠伤口模型中可喷洒水凝胶敷料治疗的示意图。B) db/db小鼠伤口的代表性照片，C) 伤口追踪叠加图像，以及D) 手术后1、4、8、12和16天有无凝胶和凝胶/MOF处理的伤口面积。E) 第16天再生皮肤的H&E和Masson染色。F) H&E染色中再生组织上皮厚度和G) 马松染色中总胶原沉积的半定量分析。H) 第16天再生上皮中的细胞角蛋白10（K10，红色）和细胞角蛋白14（K14，绿色）免疫荧光染色和J-K) 半定量分析。I) 第16天再生皮肤中I型和III型胶原的分布，通过天狼星红染色。L) 胶原I/III比率的定量

（7）凝胶/MOF抑制氧化应激，调节糖尿病伤口炎症反应

进行了一系列实验来验证凝胶/MOF可以通过减少氧化应激和调节炎症反应来加速体内的炎症-增殖转变。首先，凝胶和凝胶/MOF处理显著降低了总细胞内ROS含量(图7A和B)。在第8天，与对照组相比，在凝胶和凝胶/MOF处理后，ROS+细胞的密度显著降低。特别是，凝胶/MOF的ROS+细胞密度显著低于凝胶组(p < 0.01)，表明MOF的存在增加了ROS-清除并大大缓解了糖尿病伤口中氧化应激的微环境。在炎症的早期，M1巨噬细胞分泌促炎因子来激活炎症反应。在炎症晚期和增殖早期，M1巨噬细胞转化为M2。选择肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-10 (IL-10)和白细胞介素-4 (IL-4)作为代表性的促炎或抗炎因子，以评估凝胶/MOF在糖尿病伤口早期修复中的炎症调节。结果显示，尽管凝胶/MOF组中TNF-α基因表达没有显著降低，但凝胶/MOF组中抗炎因子IL-10和IL-4的表达显著高于对照组和凝胶组(图7C–E)。此外，从凝胶和凝胶/MOF组中提取炎症相关蛋白，然后使用细胞因子蛋白阵列进行检测(图7F和G)。凝胶/MOF组的促炎细胞因子白细胞介素-1α (IL-1α)、白细胞介素-16 (IL-16)、C–C基序趋化因子配体3 (CCL3)、CX-C基序趋化因子配体2 (CXCL2)和C-X-C基序趋化因子配体3 (CXCL3)减少，而抗炎因子IL-1ra增加。结果表明，在凝胶敷料中添加MOF增强了M1巨噬细胞向M2型的极化，并主动调节炎症微环境以促进伤口愈合。

图7. 含有Mg-GA MOF的可喷涂水凝胶敷料在糖尿病伤口中调节炎症细胞因子表达并抑制氧化应激。A) 第8天H2DCFDA（红色）的免疫荧光染色和B) ROS+细胞密度。标尺：50微米。C) 第8天糖尿病伤口中肿瘤坏死因子（TNF-α），D) 白细胞介素-10（IL-10），E) 和白细胞介素-4（IL-4）的相对基因表达。F) 和G) 第8天Gel和Gel/MOF处理后炎症相关因子水平的细胞因子阵列和分析

（8）凝胶/MOF加速神经血管网络重建

氧化应激微环境直接影响血管和神经再生。为了研究MOF维持氧化还原稳态是否可以在增殖阶段期间促进血管神经再生，研究人员检测了再生组织的血管相关基因并对血管和神经元进行CD31、β3-微管蛋白和NF200免疫荧光标记。Gel/MOF处理后HIF-1α表达与TNF-α相似。Mg-GA MOF释放Mg²⁺上调Vegf和Pdgf的表达。同时，免疫荧光结果显示Gel/MOF组可见大量CD31表达且在其周围呈现大量连续条状的β3-tubulin+着色，而对照组及Gel均较少（图8）。这些结果表明Gel/MOF促进血管内皮细胞的增殖、迁移和新血管的形成，同时伴随着新生的神经网络，其治疗后的皮肤具有更好的修复效果。

图8. 含有Mg-GA MOF的可喷涂水凝胶敷料加速了神经血管网络的重建。A-C) 在第16天，糖尿病伤口中缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（Vegf）和血小板衍生生长因子（Pdgf）的相对基因表达。D) 第16天CD31（红色）和β3-微管蛋白（绿色）的免疫荧光双重染色。比例尺：50微米。E) 第16天NF200的免疫荧光染色。比例尺：50微米。F) 第16天治疗后有无Gel和Gel/MOF的血管和G) 神经密度。H) 免疫荧光染色中NF200+的密度。I) 糖尿病再生伤口的多个指标的热图分析

研究小结：

综上所述，本研究成功制备了分散性好且形貌可调的Mg-GA MOF，实现了Mg-GA MOF合成-结构-性能之间的有效调控，并将其负载至具有抗菌性能的可喷涂水凝胶敷料中，作为微环境调节剂用于治疗慢性糖尿病伤口。Mg-GA MOF具有类酶催化活性，可通过降解释放GA快速清除ROS，维持氧化还原平衡，有效调节慢性糖尿病创面微环境。在伤口修复的后期，Mg²⁺辅助治疗可促进神经血管网络重建，而抗菌水凝胶敷料可预防细菌感染。这种简单方便的可喷涂水凝胶敷料为慢性糖尿病伤口提供了一种非药物治疗的新策略。