创伤性脑损伤（TBI）是全球死亡的重要原因，给全球经济和公共健康带来沉重负担。机械撞击会迅速破坏大脑结构，导致 TBI 的发作。原发性损伤直接损害神经元、血管和血脑屏障 （BBB）。然后，细胞和分子事件的复杂和持续的级联反应，包括线粒体损伤、炎症因子和氧化应激形成等，会导致严重的继发性损伤，从而导致进一步的神经元凋亡、坏死和功能障碍。此外，损伤会激活免疫细胞并将外周免疫细胞募集到损伤部位。活化的免疫细胞转化向 M1 促炎表型，并进一步分泌促炎因子，引起长期的炎症反应，这会抑制新神经元的整合并阻碍轴突发育。因此，TBI 后快速神经保护和减少慢性神经炎症对于最大限度地减少损伤程度和促进神经元再生至关重要。

基于此，暨南大学郭瑞研究员和军事医学研究院军事认知与脑科学研究所副所长、军事医学研究院组织工程研究中心主任王常勇教授研究开发了载有 EPO 和 MSN@IL-4 （GC/I/E） 的明胶-甲基丙烯酰 （GelMA）/壳聚糖-甲基丙烯酰 （CSMA） 光交联水凝胶，以实现 EPO 的快速释放和 IL-4 的缓慢释放。可注射 GC 水凝胶具有低溶胀性能，适应大脑的机械强度，延长降解时间，为神经再生提供有效的物理支持。研究希望 EPO 和 IL-4 的缓释能够发挥药物的不同作用，以应对急性脑损伤的不同阶段。这种定时释放水凝胶有望快速防止神经元死亡和凋亡，调节慢性炎症，并促进损伤后血管生成，以最大限度地减少对大脑的继发性损伤。

实验结果表明，GC/I/E 水凝胶具有良好的神经保护、免疫调节和促血管生成作用，能调节 PI3K-Akt、MAPK、NF-kappa B、FoxO、多巴胺能突触等信号通路，可减少星形胶质细胞活化和神经胶质细胞瘢痕形成，促进神经和突触生长，改善受损血管功能，最终促进神经功能恢复。该文章《Bioactive hydrogel synergizes neuroprotection, macrophage polarization, and angiogenesis to improve repair of traumatic brain injury》为题发表于《Materials Today Bio》（DOI：10.1016/j.mtbio.2024.101335）。

研究示意图

（1）GC/I/E 水凝胶的化学构建和表征

为了合成 GC 水凝胶，我们将甲基丙烯酸酸酐接枝到明胶和水溶性壳聚糖上，并使用自由基共价交联水凝胶。如图 1A 和 B 所示，1H NMR 结果验证了 GelMA 和 CSMA 的成功合成。甲基丙烯酸化后，GelMA 在 δ = 5.52 和 5.28 处观察到新的吸收峰，CSMA 在 δ = 5.75 和 5.53 处观察到新的吸收峰。这表明甲基丙烯酸部分的成功接枝。

TEM 图像显示 MSN 纳米颗粒是球形的，粒径均匀（图 1C）。MSN 的 IL-4 包封率为 42.12 ± 8.6 %，8 天内释放率达到 80 %。随后，通过调节 CSMA 溶液的浓度制备了一系列不同浓度的 GelMA/CSMA 水凝胶，并研究了它们的流变学、机械溶胀和降解性能。CSMA 的掺入提高了交联度并缩短了紫外线暴露时间 （10–30 s），从而保护 EPO 和 IL-4 在紫外线照射下免受损失。通过 SEM 观察 GelMA/CSMA 水凝胶，如图 1D 所示，GelMA/CSMA 水凝胶呈多孔互连结构，可促进细胞浸润以及氧和营养交换。通过流变学分析分析 GelMA/CSMA 水凝胶的粘弹性。GelMA/CSMA 水凝胶的储能模量远高于损耗模量，并且在频率和时间扫描中都保持稳定的凝胶状态（图 1E 和 F）。水凝胶的储能模量随着 CSMA 浓度的增加而增加。10 % GelMA/1 % CSMA 水凝胶的 G’ 范围为 2.0–3.0 kPa，这也是人体中枢神经系统组织的 G’ 范围。应力-应变曲线表明，压缩弹性模量随着 CSMA 浓度的增加而变化，这表明 GelMA/CSMA 水凝胶具有可调节的机械强度（图 1G）。

TBI 后，细胞代谢紊乱和炎症因子释放增加导致酸性代谢物积累和 pH 值降低。研究发现，创伤后 TBI 后人脑的 pH 值持续 24 h 内，严重 TBI 损伤病理环境的 pH 值可达 6.85 左右。基于这些基础，在 pH = 7.4 和 6.8 的 PBS 溶液中分别测量 GelMA/CSMA 水凝胶的溶胀率（图 1H）。我们发现，水凝胶的溶胀速率随着 CSMA 的加入而增加，这可能是由于壳聚糖大分子链中含有大量的亲水基团，如羟基和氨基，使其具有更好的吸水性。

图1. 水凝胶系统材料的合成及 GelMA/CSMA 水凝胶的流变性、压缩强度、体外溶胀和降解行为。(A) GelMA 的 ^1H NMR 谱图。(B) CSMA 的 ^1H NMR 谱图。(C) 介孔二氧化硅纳米颗粒的 TEM 图像。(D) 不同浓度水凝胶的 SEM 图像，(E) 时间扫描序列，(F) 频率扫描序列，(G) 应力-应变曲线，(H) 溶胀曲线（每组 n = 3，pH = 7.4），(I) 无酶降解曲线和 (J) 含酶降解曲线（每组 n = 3）

（2）GC/I/E 水凝胶具有良好的生物相容性和神经保护性能

GelMA 和 CSMA 是常见的水凝胶材料，具有良好的生物相容性，在体内被酶和水解降解，可被细胞吸收并用作能量来源或参与细胞代谢过程。为了评价 GC 水凝胶的生物相容性，通过 CCK-8 和活/死细胞活力试剂盒评估水凝胶支架对 HT22 细胞活性和细胞增殖的影响。如图 2B 和 C 所示，与 HT22 细胞孵育 24 小时后，不同浓度的 GC 水凝胶提取物和 MSN 溶液的细胞活力高于 85 %。不同组间无显著差异。细胞活力不随 CSMA 浓度的增加而降低，低浓度剂量的 MSN 溶液不产生细胞毒性。为了避免细胞毒性对脑组织的额外影响，我们最终选择了 10 % GelMA/1 % CSMA 和 100 μg/mL MSN 浓度作为水凝胶支架进行实验。我们将水凝胶支架与 HT22 以确定的浓度比例共培养 3 天，并进行活/死染色（图 2A）。活/死染色图像显示，细胞密度随孵育时间的增加而进一步增加，活绿色细胞数量较高，死亡红细胞仅偶发出现。与对照组相比，水凝胶支架不影响细胞活力，细胞增殖明显。结果表明，水凝胶支架没有明显的细胞毒性，可用于治疗 TBI。GC/I/E 水凝胶旨在通过 EPO 释放防止 TBI 后的神经损伤。如图 2D 所示，HT22 与 250 μM H₂O₂ 共孵育 24 小时后，细胞活力降至 70.00 ± 2.68 %，GC/I 处理组保护率分别为 68.16 ± 1.52 %，GC/E 处理组为 71.84 ± 3.87 %，GC/I/E 处理组保护率最高（81.84 ± 2.90 %）。这证明了 GC/I/E 水凝胶具有一定的神经保护能力。总体而言，GC/I/E 水凝胶具有良好的生物相容性和神经保护性，可以提供基本的微环境来维持神经细胞的存活和修复，因此是 TBI 治疗的有前途的候选者。

（3）GC/I/E 水凝胶在体外调节巨噬细胞向 M2 极化

将促炎性 M1 小胶质细胞/巨噬细胞转化为修复性 M2 小胶质细胞/巨噬细胞是抑制炎症并有效促进神经保护和组织修复的关键步骤。实验首先通过 LPS 诱导巨噬细胞向 M1 极化，然后与治疗组的水凝胶提取物孵育，通过流式细胞术研究巨噬细胞极化标志物 CD86 （M1） 和 CD206 （M2） 的表达水平 （图 2E）。如图 2F 所示，统计分析显示 LPS 组 CD86 的表达最高 （19.77 ± 0.13 %），这表明 LPS 成功诱导巨噬细胞向 M1 极化。GC/I/E 处理组水凝胶处理巨噬细胞中 CD86 表达的最低水平 （9.67 ± 2.20 %） 与所有其他组显著不同。如图 2G 所示，LPS 组的 CD206 表达最低 （9.29 ± 0.21 %）。在 GC/I/E 处理组中观察到水凝胶处理的巨噬细胞中 CD206 表达水平最高 （22.17 ± 1.84 %）。GC/I 与 LPS 组 （14.80 ± 1.62%） 差异显著。如图 2H 所示，所有药物治疗组的 M1/M2 比值均降低，且均与 LPS 组差异显著。GC/I/E 治疗组 M1/M2 比值最低 （0.46 ± 0.13 %），这表明 GC/I/E 在促进 M1 表型向 M2 表型极化方面最有效。综上所述，结果表明，在 IL-4 和 EPO 的共同作用下，GC/I/E 水凝胶在促进巨噬细胞 M2 表型的极化方面具有有利作用，这可能减少 TBI 后的神经炎症，减少星形胶质细胞的活化。

（4）GC/I/E 水凝胶在体外促进血管生成

血管生成也是调节 TBI 组织再生的关键因素。如图 2I 所示，对照组在 4 小时后未观察到血管生成，但已经可以看到生长成血管网络的趋势。GC 水凝胶治疗组能够形成一些血管网络。在 GC/E 和 GC/I 水凝胶治疗组中可以检测到明显的管腔形成。GC/E 水凝胶处理组的血管生成程度优于 GC/I 水凝胶处理组。这意味着 EPO 和 IL-4 在体外都能促进内皮细胞血管生成，但 IL-4 促进血管生成的能力有限，EPO 的促血管生成作用大于 IL-4。在 GC/I/E 水凝胶治疗组中可以发现大量的血管网络结构和最长管的形成。这表明在 EPO 和 IL-4 的协同作用下，GC/I/E 水凝胶处理组可以显著增强内皮细胞的血管生成作用。根据观察结果，如图 2J-M 所示，定量测量的统计分析表明，GC/I/E 水凝胶处理组的成管效果最好。处理组内皮细胞的血管网络数量、管形成和分支和管形成长度显著增加，与对照组差异有统计学意义。这些结果表明，GC/I/E 水凝胶可能通过刺激宿主血管内皮细胞有效促进新生血管形成。

图2. GC/I/E 水凝胶的体外评估。(A) GC/MSN 提取物与 HT22 细胞共培养 3 天的活/死染色：AM（绿色），PI（红色），比例尺 = 100 μm。(B) 不同浓度比 MSN 溶液共培养 24 小时后的细胞活力（n = 6），(C) 不同浓度比 GC 水凝胶提取物与 HT22 细胞共培养 24 小时后的细胞活力（n = 4）。(D) 各组水凝胶提取物在 250 μM H2O2 环境下与 HT22 细胞共培养 24 小时后的细胞活力图（n = 5，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）。(E) 各组水凝胶处理 RAW264.7 细胞后 CD206 和 CD86 表达的流式细胞术分析（n = 3，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）。(F) CD86 阳性细胞表达，(G) CD206 阳性细胞表达，(H) 各组基于流式细胞术结果的 M1/M2 比例定量分析（n = 3，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）。(I) 各组水凝胶培养 HUVEC 的体外管形成图（n ≥ 6，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001，比例尺 = 200 μm）。对各组 HUVEC 进行定量分析的结果包括 (J) 节段数量，(K) 管数量，(L) 节点数量，以及 (M) 总节段长度（n ≥ 6，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）

（5）GC/I/E 水凝胶降低低温 TBI 后脑水肿的程度

据报道，低温损伤模型 （CIM） 的病理特征与人类 TBI 的许多标志性特征相同，并且在一定程度上可以模拟人类 TBI 的各种病理生理特征，如细胞损伤、血管损伤、炎症免疫反应、血脑屏障破坏和神经功能障碍。CIM已被用于评价各种药物对 TBI 病理过程的治疗效果，帮助研究人员确定脑损伤治疗的时间窗，以及研究不同治疗方法联合使用的效果。在这里，研究了 GC/I/E 水凝胶在 CIM 中的治疗效果。脑水肿是 TBI 的有害并发症之一，脑水肿的严重程度被认为与脑损伤的严重程度直接相关。研究使用 T2 加权 MRI 估计 TBI 后第 3 、 7 、 14 、 28 天的脑水肿。如图 3A 所示，对照组在 7 d 损伤部位出现一个大的坏死腔，脑疝的程度随着时间的推移而变得更加严重。可以看出，添加水凝胶可以支持细胞浸润和神经再生，并维持一定的颅内压。GC、GC/I、GC/E 和 GC/I/E 水凝胶处理组脑疝程度趋于降低，腔面积减少，这表明水凝胶治疗促进脑损伤的组织学修复。相比之下，GC/I/E 水凝胶处理组显示脑疝程度最低，并且在 28 d 时脑组织学病变腔最小。Sham 组出现轻微的脑疝，这可能是由于 TBI 模型中切除了颅骨引起的。这些结果表明，GC/I/E 水凝胶可以减轻 TBI 后脑水肿，进而减轻 TBI 后脑组织水肿引起的继发性损伤。

（6）GC/I/E 水凝胶可防止神经元损伤并促进低温 TBI 后脑组织重塑

28 d 的大脑一般图像显示，对照组可观察到大空腔，并且有明显的血瘀区域（图 3B）。。通过 H&E 染色进一步研究了 TBI 组织的完整性以及 TBI 皮层中神经元细胞的形态变化（图 3C）。相应的 H&E 染色图像（矢状）也与图 3B 中观察到的图像大致相同。对照组和 GC 水凝胶治疗组的病灶腔到达白质和海马体，GC/I 、 GC/E 和 GC/I/E 水凝胶治疗组小鼠对周围组织的损伤明显较小。GC/I/E 水凝胶处理组细胞浸润致密，无可见空泡组织。H&E 染色进一步发现，Sham 组皮质神经细胞排列整齐，形态规则。对照组和 GC 水凝胶治疗组皮质神经细胞杂乱无章，形态不规则，可观察到大量退化的嗜碱性坏死神经元。在这些坏死细胞中没有看到明显的核仁，可能是由于核实变。GC/I 和 GC/E 水凝胶组坏死神经元较少，而皮质神经元细胞排列杂乱无章。GC/I/E 水凝胶治疗组神经元坏死明显改善，大脑皮层神经细胞排列更整齐，细胞结构完整，形态规则，脑结构趋于正常化。这表明 EPO 和 IL-4 协同作用非常好，并且 GC/I/E 水凝胶具有神经保护作用并减轻神经元坏死。

尼氏体染色是神经元损伤的敏感指标。在生理条件下，尼氏小体大而多，这反映出神经细胞合成蛋白质的效率更高。在神经元损伤中，尼氏小体的数量会减少甚至消失。如图 3D 所示，Sham 组中的 Nissl 体数量众多且排列整齐。对照组皮层神经元结构杂乱无章（神经元细胞受损、碎片化或萎缩），Nissl 小体数量排列间距过大，可能存在大量神经元缺失。GC 水凝胶治疗组的 Nissl 囊泡结构杂乱无章，可见神经瘢痕形成，这会抑制脑组织的进一步修复和再生。与对照组和 GC 组相比，其他水凝胶处理组退化神经元细胞数量显著减少，GC/I/E 水凝胶处理组的尼氏小体排列更整齐。结果进一步验证了 GC/I/E 水凝胶的神经保护和再生作用。

图3. GC/I/E 水凝胶在冷冻损伤型创伤性脑损伤（TBI）修复中的体内评估。(A) T2 加权 MRI 图像。(B) 各组材料治疗 28 天后的一般图像，(C) H&E 染色图像，(D) Nissl 染色图像

（7）GC/I/E 水凝胶增强低温TBI 后的抗炎作用

TBI 后，星形胶质细胞的细胞密度往往与炎症因子呈正相关。星形胶质细胞的激活增加了促炎细胞因子和趋化因子的分泌，这进一步加剧了继发性神经元损伤，星形胶质细胞的增殖形成神经胶质细胞瘢痕，阻止轴突生长，导致神经发生受损。为了确定 GC/I/E 水凝胶的神经炎症调节能力，我们计算了 TBI 后第 3 天、第 7 天和第 28 天病灶周围皮层中星形胶质细胞的密度，星形胶质细胞是神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的标志物。如图 4A 所示，在 TBI 后的第 3 天和第 7 天，对照组和 GC 水凝胶处理组中的星形胶质细胞表现出肥大形态，这是星形胶质细胞活化的标志。随着治疗时间的增加，两个水凝胶治疗组的 GFAP 比例均呈降低趋势。创伤区域星形胶质细胞的减少促进了组织恢复，因为它为组织再生和愈合过程提供了有利的环境。第 3 天和第 7 天，GC/I/E 水凝胶治疗组在所有治疗组中最低，表明 GC/I/E 水凝胶治疗在减少神经炎症方面更有效，然而，每组 GFAP 的密度没有统计学意义差异。TBI 28 天后，对照组损伤区星形胶质细胞密度百分比显著升高 （0.92 ± 0.01 %） （图 4E），并观察到明显的瘢痕形成。与对照组相比，GC 水凝胶处理组在 28 天 （0.64 ± 0.08%） 的星形胶质细胞密度较低，并且可以观察到较少的神经瘢痕形成。GC/E 水凝胶处理组的星形胶质细胞密度也显示出降低的趋势 （0.59 ± 0.16 %），这表明 GC/E 水凝胶处理组的神经炎症得到改善。这可能归因于EPO还具有促进巨噬细胞M2极化的能力，并且神经保护药物可以减少过度的氧化应激和失调的能量代谢，延迟星形胶质细胞的活化，并缓解炎症。GC/I 水凝胶治疗组在 7 d 出现星形胶质细胞活化，28 d 时 GC/I 中 GFAP 比例最低 （0.34 ± 0.17 %），表明 IL-4 的免疫调节作用可有效减少 TBI 诱导的慢性继发性星形胶质细胞增生和神经炎症，这与对照组有统计学差异（图 4D）。上述结果表明 GC/I/E 水凝胶的巨噬细胞 M2 极化和神经保护作用可以减少炎症细胞的浸润，减少神经炎症，改善脑组织的炎症微环境，从而促进脑组织的修复。

（8）GC/I/E 水凝胶促进低温 TBI 后的神经元增值

基于神经保护和炎症调节作用，我们预计 TBI 后神经元存活和再生会得到改善。因此，我们在 TBI 后第 3 天、第 7 天和第 28 天观察到神经元特异性标志物 NeuN 的免疫荧光染色。如图 4B 所示，Sham 组没有明显的细胞死亡或神经元丢失。3天NeuN 比例的统计分析（图 4E）显示，Sham 组与其他组之间存在统计学差异，表明 TBI 后神经元严重丢失，但神经元数量随着水凝胶植入和药物治疗而增加。在 EPO 和 MSN@IL-4 联合使用下，GC/I/E 水凝胶处理组的 NeuN 密度最高 （0.91 ± 0.02 %），并且与对照组 （0.36 ± 0.12 %） 显著不同。这证明了神经保护剂的保护作用。如 7d 所示，除假手术组和对照组外，所有组的 NeuN 密度均增加（图 4F），表明神经元再生的趋势。在损伤修复的第 28 天（图 4G），与 7d 相比，对照组和 GC 水凝胶治疗组的 NeuN 密度降低，这与之前发现的 TBI 导致神经元凋亡、神经元数量逐渐减少和修复效果较差的发现一致。在 28 天时，观察到 GC/I/E 水凝胶处理组的 NeuN 密度进一步升高 （1.07 ± 0.04 %）。GC/E 水凝胶治疗组 （0.74 ± 0.14 %） 的神经再生优于 GC/I 水凝胶治疗组 （0.68 ± 0.11 %）（图 4G）。这表明在用神经保护剂及时保护后，神经元再生更强。而M2极化巨噬细胞不仅能减少神经炎症，还能促进神经修复，这与以往的研究一致。

突触后密度 95 蛋白 （PSD95） 对突触结构和功能的可塑性至关重要，有助于支持神经发育和提高认知能力。如图 4C 所示，对照组显示 PSD95 的表达最少 （1.48 ± 0.57 %），而 GC/I/E 水凝胶处理组 （6.38 ± 1.99 %） 的 PSD95 含量最高。与对照组相比，GC 水凝胶处理组 （3.00 ± 0.19%） 显示 PSD95 水平显着升高，GC/I 和 GC/E 水凝胶处理组表现出比单个 GC 水凝胶处理组更高的表达，这与 NeuN 结果一致（图 4H）。根据以前的研究结果，神经保护和炎症调节可以挽救突触蛋白的丢失。

图4. GC/I/E 水凝胶在改善炎症微环境和促进神经发生中的评估。不同水凝胶处理脑组织的免疫荧光染色图像：(A) GFAP（红色），DAPI（蓝色），比例尺 = 100 μm；(B) NeuN（绿色），DAPI（蓝色），比例尺 = 100 μm；(C) PSD95（绿色），DAPI（蓝色），比例尺 = 200 μm。(D) GFAP 在第28天的统计分析图（n ≥ 3，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01）。NeuN 在（E）第3天、（F）第7天和（G）第28天的统计分析图（n ≥ 3，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）。(H) PSD95 在第28天的统计分析图（n = 4）

（9）GC/I/E 水凝胶促进低温 TBI 后血管再生

我们通过观察光声成像拍摄的高分辨率血管图像和通过散射流成像监测脑血流 （CBF），评估 GC/I/E 对 TBI 后脑血管结构和功能修复的影响。如图 5A 所示，我们使用高灵敏度光声显微成像在治疗 28 天时获得活体小鼠 TBI 的血管造影。影像学检查显示，对照组表现为局部肿胀、血管畸形，几乎看不到微血管结构。与 GC 和 GC/I 水凝胶处理组相比，GC/E 和 GC/I/E 水凝胶处理组的微血管结构明显增加，与 Sham 组的血管结构接近。此外，我们分析了受伤血管的血红蛋白浓度，如图 5G 所示。TBI 后血红蛋白浓度的降低 （12.53 ± 2.25%） 表明严重损伤导致受伤脑组织更加缺氧状态。GC/E （33.78 ± 6.85 %） 和 GC/I/E （27.86 ± 2.05 %） 水凝胶处理组的血红蛋白浓度均显著高于各组。这表明 EPO 介导的神经保护和血管生成能力可以显着改善 TBI 后的血管再生。如图 5B 所示，每组均对损伤部位进行散射血流成像。图 5C、D 和 E 分别显示了测试时的彩色、黑白和相应的流动成像图。统计分析显示 GC/E 和 GC/I/E 水凝胶治疗组的血流量增加。与对照组相比，GC/I/E 治疗组的血流速度增加了 36%（图 5F）。体内和体外实验结果一致，TBI 后血管形成较弱，GC/I/E 水凝胶促进 TBI 后血管再生，改善 TBI 中明显的缺氧和弱血流。

图5. GC/I/E 水凝胶在冷冻损伤型创伤性脑损伤（TBI）血管化修复中的评估。(A) 不同组在 TBI 治疗 28 天后的光声成像和 (B) 激光散射血流成像。(C) 彩色、(D) 黑白脑部图片和 (E) 血流的激光散射成像图；(F) 血流速度统计（n = 4）。(G) 血红蛋白浓度统计（n ≥ 4，∗p ≤ 0.05，∗∗p ≤ 0.01，∗∗∗p ≤ 0.001，∗∗∗∗p ≤ 0.0001）

（10）GC/I/E 水凝胶增强神经功能修复

改善继发性 TBI 引起的神经功能丧失具有临床意义。我们根据时间线评估了 GC/I/E 水凝胶治疗后神经功能修复的水平，如图 6A 所示。我们设计了 mNSS 行为实验来测试小鼠在运动、平衡、感觉和反射方面的神经行为严重程度（图 6B）。所有 TBI 组的 NSS 评分均升高，并随着治疗时间的增加而逐渐下降。第 7 天，GC/I 、 GC/E 和 GC/I/E 水凝胶处理组 NSS 评分显著降低，GC/I/E 水凝胶处理组 NSS 评分最低，与对照组差异有统计学意义。这表明神经保护、炎症调节和血管生成改善了治疗后小鼠神经行为障碍的程度。小鼠新物体识别 （NOR） 测定显示 （图 6C） TBI 小鼠对新物体的探索减少，表明 TBI 损害了短期非空间记忆。进行莫里斯水迷宫试验以评估 TBI 后小鼠的学习和记忆能力。如图 6D 所示，在受伤后 15 天训练开始后 5 天内，找到平台的时间（逃逸潜伏期）逐渐减少。在学习后期，GC/I、GC/E 和 GC/I/E 水凝胶治疗组的潜伏期明显减少且具有统计学意义，反映了 TBI 小鼠的空间学习能力。其中，GC/I 水凝胶处理组的运动速度较低，可归因于体内血管再生较少和血管功能恢复较差（图 5）。在测试当天，分析了记忆检索能力，我们分析了测试后对平台区域的访问次数、在目标象限花费的时间和游泳速度（图 6E、F 和 G）。分析表明，GC/I/E 水凝胶处理组在移除平台后测试得更好，显示出与 Sham 组小鼠相当的记忆容量，这与平台区域的访问次数图表相对应（图 6H）。尽管如此，由于在治疗后期小鼠个体水平之间的差距有点大，因此没有观察到统计学差异。综上所述，IL-4 对炎症微环境的调节可进一步影响神经功能的改善，EPO 的神经保护和血管再生作用可有效恢复 TBI 后小鼠的行为科学。EPO 和 IL-4 的协同作用导致 GC/I/E 水凝胶的神经功能恢复更加突出。研究结果表明，增强神经保护、血管生成和免疫调节的策略可能为改善 TBI 后的功能提供有希望的机会。

（11）GC/I/E 水凝胶促进 TBI 修复机制的评估

 RNA 序列分析进一步探讨了 GC/I/E 水凝胶的 TBI 处理机制。如图 7A 中的差异基因火山图所示，与 TBI 组相比，GC/I/E 水凝胶处理组有 376 个富集的差异表达基因 （DEG） 具有统计学意义，其中包括 110 个上调基因和 266 个下调基因。为了探索 GC/I/E 水凝胶的功能特征和作用途径，进行了基因本体论 （GO） 分析和京都基因与基因组百科全书 （KEGG） 分析。前 20 个 GC 和 KEGG 基因富集气泡图中的大量基因与信号传导、神经活性、炎症和突触再生相关。富含 GO 的气泡图还显示，治疗与免疫反应、细胞凋亡、程序性死亡和细胞因子活性相关（图 7C）。研究选择了与 TBI 治疗相关的富含 KEGG 的气泡图（图 7D）。在这些通路中，炎症相关通路包括 MAPK 信号通路、NF-kappa B 信号通路、IL-17 信号通路、趋化因子信号通路等。细胞凋亡相关通路包括 PI3K-Akt 信号通路、NOD 样受体信号通路、FoxO 信号通路、细胞凋亡等。血管生成相关通路包括 HIF-1 信号通路、VEGF 信号通路等。神经发生相关途径包括血清素能突触、多巴胺能突触、神经活性配体-受体相互作用、GABA 能突触、胆碱能突触等。GC/I/E 水凝胶处理显著改变了与细胞凋亡、神经炎症、神经元存活、神经元突触生长和神经功能障碍相关的基因表达。例如，作为一种细胞表面蛋白，Fas 可以与 Fas 配体 （FasL） 结合以介导细胞凋亡，并且在 TBI 后显着增加。GC/I/E 水凝胶处理后基因表达降低，表明水凝胶抑制了细胞凋亡。参与小胶质细胞和巨噬细胞活化以及 M1 表型极化调节的炎性趋化因子 CCL2 （CC 趋化因子配体 2） 在 TBI 后显著增加，是 TBI 后促进炎症的代表。GC/I/E 水凝胶处理后的减少表明水凝胶抑制炎症。Bdkrb1（缓激肽受体 B1）是缓激肽信号转导的转导介质，可激活过多的促炎细胞因子并加剧焦虑样行为，这种行为在 GC/I/E 水凝胶处理后显著减少。补体蛋白 C3 的过表达会降低神经突生长和神经元活力，促进神经元丢失，并限制体内轴突再生。GC/I/E 水凝胶处理后 C3 基因表达显著降低。Pla2g3（III 组分泌型磷脂酶 A2）可促进神经元突触生长并抑制神经元死亡。Edn1 （Endothelin 1） 诱导血管生成途径激活，参与TES 参与生物体的炎症反应，并调节细胞凋亡。Tnr （Tenascin-R） 参与神经元突触生长和神经元细胞粘附、轴突导向、髓鞘形成和突触可塑性。Tnr 缺乏会导致非进行性神经发育障碍。这些促进神经元存活和血管生成的基因在水凝胶处理后显着增加。上述基因的调控验证了 EPO 和 IL-4 的功能，表明 GC/I/E 水凝胶对 TBI 具有良好的治疗效果。RNA 测序结果显示，GC/I/E 水凝胶通过调节炎症、凋亡、血管生成和神经途径预防神经损伤，改善神经炎症环境，促进血管、神经元和突触的再生以及神经功能修复。

图7. GC/I/E 水凝胶在调节 TBI 治疗中的机制。(A) 差异基因火山图。(B) 筛选出的与神经治疗相关的差异基因热图（n = 3）。(C) GO 富集气泡图（n = 3）。(D) KEGG 富集气泡图（n = 3）

（12） GC/I/E 水凝胶在体内具有优异的生物相容性

研究通过 H&E 染色进一步审查了 GC/I/E 水凝胶的全身生物安全性（图 8）。与 Sham 组相比，所有实验组小鼠主要器官均未观察到明显的组织损伤或形态变化，表明该制剂无显著生物毒性。

图8. 各水凝胶组的体内生物相容性评估。治疗 28 天后小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的 H&E 染色图像

研究小结：

本研究开发了一种多功能水凝胶，并展示了其对脑损伤的治疗应用。我们使用甲基丙烯酸酐接枝明胶和壳聚糖作为水凝胶骨架，并加载 EPO 和 MSN@IL-4 （GC/I/E），它们在注射到脑损伤部位后交联形成凝胶。水凝胶具有良好的生物相容性，能迅速发挥神经保护作用，通过调节免疫细胞调节炎症环境，同时促进血管生成。经体内证实的低温脑损伤模型，GC/I/E 水凝胶处理后，神经元损伤减少，炎症减少，神经瘢痕形成减轻，神经元再生和血管重塑得到有效促进。GC/I/E 水凝胶可能为治疗 TBI 提供新的临床选择。