肿瘤微环境（TME）通过代谢重编程影响肿瘤的异质性、侵袭性和转移，导致乳酸增加和免疫抑制性TME的形成。为消耗乳酸，开发了乳酸氧化酶（LOx）等方法，但LOx受缺氧环境限制，氧化应激效应也可能不足以达到最佳治疗效果，因此改善肿瘤氧合至关重要。纳米酶因其类酶活性在肿瘤治疗中有潜力。将LOx与具有催化功能的纳米酶结合，有望增强乳酸催化和细胞毒性·OH的生成，提高治疗效果。光声（PA）成像可实时监测催化过程中的分子变化，为肿瘤催化治疗的临床应用提供支持。

基于上述背景，深圳大学黄鹏团队研究构建了双酶驱动的级联反应平台（ILH），由修饰透明质酸的铱金属纳米酶和乳酸氧化酶（LOx）组成。LOx通过氧化乳酸生成H₂O₂，降低乳酸水平，从而将免疫抑制性TME转化为免疫反应性，促使巨噬细胞从M2型向M1型极化。铱纳米酶具类CAT活性，分解H₂O₂生成O₂，缓解肿瘤缺氧，并通过PA成像监测氧合变化。其类POD和GSHOx活性在酸性环境中生成细胞毒性·OH并消耗GSH，削弱肿瘤抗氧化防御，激活免疫原性细胞死亡（ICD）。此外，铱纳米酶的光热性能增强级联催化效果，并赋予ILH强PA响应，实现实时监控级联治疗过程。该文章于2024年10月21日以《Dual Enzyme-Driven Cascade Reactions Modulate Immunosuppressive Tumor Microenvironment for Catalytic Therapy and Immune Activation》为题发表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c07374）。

研究示意图

（1）ILH的制备与表征

   通过湿化学还原法合成了聚烯丙胺功能化的铱金属纳米酶（Ir-PAH）。HAADF-STEM和TEM图像显示Ir-PAH呈层状结构，平均直径约为100 nm（图1a,b），且高倍率下可见多孔网络结构（图1c）。AC-STEM显示晶格间距为0.21 nm，对应Ir的面心立方结构（111）晶面（图1d）。AFM数据显示Ir-PAH厚度约为6.3 nm（图1e,f）。负载LOx和HA后，Ir金属纳米酶的形貌无明显变化，元素分布图显示硫元素均匀分布，表明LOx成功负载（图1g）。XPS光谱确认了Ir-PAH的形成（图1h）。DLS测得Ir-PAH水动力直径增至150.8 ± 3.7 nm，经HA修饰后约为168.3 ± 5.1 nm（图1i）。表面电位测量表明ILH的zeta电位为−27.5 ± 0.7 mV，而Ir-PAH为36.5 ± 2.6 mV，归因于HA的存在（图1j）。

图1. (a) Ir-PAH 的 TEM 图像；(b) Ir-PAH 的 HAADF-STEM 图像；(c) Ir-PAH 的 HAADF-STEM 图像，箭头表示孔隙的存在；(d) Ir-PAH 的高分辨率 TEM 图像，显示晶格距离；(e) AFM 图像；(f) 相应的 Ir-PAH 高度剖面图；(g) ILH 的元素映射；(h) Ir-PAH 的 XPS 光谱；(i) Ir-PAH、Ir@LOx 和 ILH 的大小分布；(j) Zeta 电位

（2）ILH的光热性能与多酶活性

紫外–可见–近红外（UV–vis–NIR）光谱显示ILH在NIR-II区具有显著吸收，且吸收强度随浓度增加（图2a）。1064 nm处的消光系数为7.15 L g⁻¹ cm⁻¹。激光照射下，ILH溶液温度显著升高，随浓度增加而增强（图2b,c）。ILH展现出良好的光热稳定性，NIR-II光热转换效率为39.7%，优于许多用于NIR-II光热治疗的制剂。多次激光开/关循环后，ILH的光热特性和形貌无明显变化，表明其光热稳定性良好。Ir-PAH的GSHOx样活性通过DTNB指示剂验证，结果显示其消耗GSH并生成Ir³⁺，进一步氧化为Ir⁴⁺以消耗GSH（图2d,e）。Ir-PAH的CAT样活性评估显示H₂O₂引入导致溶解氧（DO）逐渐增加，且激光照射下DO产量提升1.42倍（图2f）。Ir-PAH对H₂O₂的转化符合米氏动力学，Km值为44.86 mM。通过基于TMB的比色法测试了Ir-PAH的POD样活性，表现出米氏动力学，Km值为24.12 mM，Vmax为0.57 μM s⁻¹（图2g,h）。激光照射下TMB氧化增加1.56倍。为评估ILH的级联催化性能，通过ESR检测生成的·OH，结果表明ILH在乳酸存在下可生成·OH，且激光照射下·OH产量增加（图2i）。在模拟体液中，TEM图像显示Ir金属纳米酶在12天内逐渐降解，产生超小Ir纳米颗粒，表明其具有良好生物降解性（图2j）。

图2. (a) 不同浓度 ILH 的紫外-可见-近红外光谱；(b) 1064 nm 激光照射和不照射时不同浓度 ILH 水溶液的光热谱图；(c) 相应的热像图；(d) DTNB 与谷胱甘肽和不同浓度的 Ir-PAH 在不同时间孵育的紫外可见光谱；(e) GSH 处理前后 Ir-PAH 的 Ir 4f XPS 光谱。加入 GSH 后，Ir 4f 峰向结合能较低的方向移动，表明生成了更多的 Ir³⁺；(f) 不同组（H₂O₂、H₂O₂ + Ir-PAH 和 H₂O₂ + Ir-PAH + 激光）的产氧量。H₂O₂: 1 M, Ir-PAH: 10 μg·mL⁻¹；(g) 室温下 Ir-PAH 的 cat 样活性动力学测定；(h) 室温下 Ir-PAH pod 样活性的动力学测定；(i) 用乳酸溶液（20 mM）孵育 ILH，激光照射或不照射时的 ESR 光谱；(j) 在 37 ℃ 的 SBF 培养基（pH = 7.4）中孵育不同时间后的 ILH 的 TEM 图像

（3）ILH的靶向摄取与抗肿瘤作用

       天然透明质酸（HA）因其优异的生物功能、生物相容性和生物降解性，能结合过表达CD44受体的肿瘤细胞，从而实现特异性肿瘤靶向递送。细胞毒性实验显示，Ir@HA（IH）对4T1细胞毒性较低，细胞存活率高于80%；而ILH的细胞毒性显著增加，激光照射进一步提高其毒性（图3a）。细胞迁移分析表明，ILH和激光照射可显著抑制4T1细胞迁移，ILH+激光组的迁移速率最低（图3b,c）。ILH+激光组在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术中显示出强绿色荧光信号，表明ROS生成（图3d,e），且通过HPF检测到的·OH生成进一步验证了Ir类金属纳米酶的POD样活性（图3f）。通过比率荧光探针C11-BODIPY581/591检测脂质过氧化（LPO），ILH+激光组显示出较强的绿色荧光信号，表明ROS增强引发的LPO（图3g）。此外，ILH+激光组中更高的JC-1单体比例（60.2%）证明了线粒体损伤效应（图3h）。天然透明质酸（HA）因其优异的生物功能、生物相容性和生物降解性，能结合过表达CD44受体的肿瘤细胞，从而实现特异性肿瘤靶向递送。

图3. (a) 在 1064 nm 激光照射（0.6 W·cm⁻², 5 min）下，不同浓度 IH 或 ILH 孵育 4T1 细胞后的相对存活率；(b) 采用高含量成像系统捕获不同处理后的 4T1 细胞显微图像，并用 Harmony 软件进行处理；(c) 4T1 细胞迁移率的定量分析。数据以均数 ± 标准差（SD）表示，n = 3；(d) 流式细胞术分析不同处理后 4T1 细胞 ROS 生成情况；(e) DCFH-DA 染色 4T1 细胞的共聚焦图像；(f) 不同处理后的 HPF 图像。标尺：20 μm；(g) 不同处理后 LPO 染色 4T1 细胞的共聚焦图像；(h) 不同处理后 j-单体和 j-聚集体的流式细胞术分析

（4）ILH对TAMs极化的体外调控

      乳酸消耗诱导巨噬细胞表型转变，ILH在体外有效减少乳酸浓度，并通过共培养4T1细胞和M2型巨噬细胞，促进巨噬细胞由M2型向M1型转变（图4a, b）。流式细胞术结果显示，ILH+激光组M1型巨噬细胞比例增加（图4c），与RAW264.7细胞结果一致。IH通过催化H2O2分解为O2缓解肿瘤缺氧（图4d,h），NIR-II激光增强该过程，并降低HIF-1α水平（图4e,i）。光热增强催化疗法产生ROS，诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。ILH+激光组显著增强CRT暴露和HMGB1释放，促进树突状细胞成熟并激活免疫反应（图4f, g, j, k）。ELISA检测结果显示ILH+激光组中HMGB1、CRT表达和ATP分泌水平显著提高，表明其引发了强烈的ICD反应。

图4. (a) 乳酸诱导的 M2 型巨噬细胞复极化过程中形态学转变示意图；(b) 免疫荧光图像描绘了 ILH 处理后 MCTS 内巨噬细胞的空间排列（红色：M1 巨噬细胞，绿色：M2 巨噬细胞，蓝色：细胞核）；(c) 对抗 CD86 染色的 RAW264.7 细胞进行流式细胞术分析；(d) 低氧条件下（1% O₂, 5% CO₂, 94% N₂）不同处理后 [Ru(dpp)₃]Cl₂ 染色的 4T1 细胞代表性共聚焦图像；(e) 缺氧条件下不同处理后的 4T1 细胞共聚焦图像，用 phalloidin（绿色）和抗 HIF-1α（红色）染色；(f) CRT 表达的共聚焦图像；(g) HMGB1 蛋白释放；(h) [Ru(dpp)₃]Cl₂、(i) HIF-1α、(j) CRT 和 (k) HMGB1 在不同处理（PBS、激光、LOx、IH、IH + 激光、ILH 和 ILH + 激光）后荧光信号的定量

（5）In Vivo 3D PA成像引导的级联催化过程

考虑到Ir-PAH在激光照射下的光热特性，该研究评估了IH和ILH的PA成像能力。在体外实验中，IH和ILH在NIR-II区域的PA信号强度与其浓度呈正比（图5a, b）。由于ILH与OxyHb和DeoxyHb在NIR范围的PA吸收光谱差异，可以通过检测其特征信号区分体内级联催化过程的动态分子事件。在小鼠肿瘤模型中，IH或ILH通过静脉注射后，肿瘤部位的PA信号强度在8小时后增加约2.8倍（图5c,d），显示了ILH在PA成像中的潜力。3D PA成像结合OxyHb和DeoxyHb的PA/US图像（图5e）及定量值（图5f,g）表明，PBS组的PA信号稳定，而IH组的OxyHb信号显著增强，约为初始值的3.5倍，同时DeoxyHb信号减弱，表明IH通过催化H₂O₂生成O₂来改善肿瘤缺氧。ILH组的OxyHb信号强度约为IH组的76.3%，可能是由于LOx催化乳酸时部分O₂被消耗。通过多波长PA成像实时监测肿瘤内血氧饱和度（sO₂）变化，1064 nm激光照射进一步增强ILH的CAT样活性，提升sO₂水平，从而缓解肿瘤微环境（TME）的缺氧状态（图5h）。

图5. (a) 970 nm 激光激活下不同浓度 IH 或 ILH 溶液的 PA 图像；(b) 相应的 PA 值；(c) 静脉注射 IH 或 ILH 后肿瘤组织随时间变化的 3D PA/US 图像；(d) 随时间变化的 PA 振幅量化；(e) 静脉注射 PBS、IH 或 ILH 后肿瘤组织中 DeoxyHb 和 OxyHb 的 3D 渲染 PA/US 图像；(f) 测定肿瘤部位的 OxyHb 水平；(g) 肿瘤部位脱氧血红蛋白定量；(h) 激光照射和静脉注射 ILH 后小鼠肿瘤组织中 sO₂ 水平的 3D PA/US 图像；(i) 肿瘤组织中 sO₂ 值的定量测定

（6）In Vivo生物安全评估、级联催化治疗与免疫激活

基于ILH的体外治疗效果，该研究进一步考察了其体内抗肿瘤效果。在4T1肿瘤模型中，借助体内PA成像，IH和ILH注射8小时后对肿瘤组织进行NIR-II激光照射。在1064 nm激光下，ILH处理的肿瘤温度升高至47.3 °C（图6a,b）。4T1肿瘤模型被分为PBS、激光、LOx、IH、IH+激光、ILH和ILH+激光7组。结果显示，ILH+激光组的肿瘤生长抑制率(TGI)达90.1%，表现出显著的抗肿瘤效果（图6c,d），且治疗期间体重无显著变化（图6e），证明治疗的安全性。H&E和Ki-67染色表明，ILH+激光组有显著的组织损伤和细胞增殖抑制，TUNEL染色结果显示该组凋亡信号最强（图6g,h）。此外，肺部H&E染色显示，ILH+激光组肺转移灶减少92.1%，表明其强大的抗转移效果（图6i,j）。这些结果表明，光热增强的催化治疗具有诱导癌细胞凋亡和激活免疫系统的潜力，有助于阻止肿瘤转移。

图6. (a) 不同处理下肿瘤部位的光热成像图像；(b) 相应的温度变化。激光参数：1064 nm，0.6 W·cm⁻²，10 min；(c) 指定治疗后的肿瘤生长曲线；(d) 肿瘤平均重量；(e) 小鼠体重；(f) 指示治疗后小鼠肿瘤生长曲线；(g) 指示治疗后肿瘤切片的 H&E、Ki-67 和 TUNEL 染色图像；(h) 指定治疗后肿瘤组织 TUNEL 染色图像阳性率定量；(i) 代表性肺组织的 H&E 染色图像。比例尺：2 mm。如箭头所示的放大图像；(j) 各实验组肺转移结节

（7）免疫抑制TME调控与免疫激活

该研究探索了ILH在抗肿瘤和抗转移应用中的体内免疫调节机制。4T1肿瘤模型及相关干预措施的具体方法如图7a所示。实验证明，实体肿瘤中的缺氧和乳酸积累会引起巨噬细胞大量浸润，但这种浸润往往削弱巨噬细胞功能，从而促进肿瘤发生和转移。通过肿瘤切片的HIF-1α免疫荧光染色分析（图7b,c），研究发现ILH显著缓解了肿瘤缺氧状态，下调HIF-1α表达，并提高了M1型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的比例。ILH通过氧气生成和乳酸消耗协同作用，有效调控了免疫抑制TME。

进一步的流式细胞术分析表明，与对照组相比，ILH处理后M1/M2比值提高了约5.6倍（图7d,g）。催化治疗产生的ROS诱导肿瘤细胞损伤，释放的肿瘤相关抗原（TAAs）被转移至淋巴结，由树突状细胞（DCs）呈递至T细胞，激发适应性免疫反应。DCs成熟度的分析显示，ILH+激光组中成熟DC比例较PBS组高出2.5倍（图7e,h）。此外，CD8+ T细胞在肿瘤监控中具有关键作用，而CD4+ T细胞则主要调控并协调其他免疫细胞，因此测定了治疗后肿瘤组织中的CD4+和CD8+ T细胞比例（图7f–j）。ILH和ILH+激光组均表现出显著的T细胞浸润，ILH+激光组中CD3+CD8+ T细胞比例较PBS组增加4.2倍。最后，ELISA分析显示，ILH+激光组小鼠血清中IFN-γ、IL-6和TNF-α水平分别提高了1.9倍、2.2倍和2.0倍（图S26），表明ILH有效激活了抗肿瘤免疫反应。

图7. (a) 小鼠处理过程示意图；(b) 不同处理后肿瘤组织 HIF-1α 表达的组织学染色图；(c) 肿瘤组织内巨噬细胞免疫荧光染色。蓝色、绿色和红色荧光分别表示细胞核、CD206 和 CD86；(d) 第 5 天不同处理后浸润肿瘤的 M2 和 M1 巨噬细胞的代表性流式细胞术分析；(e) 不同处理后第 5 天成熟 DC 的代表性流式细胞术分析；(f) 以 CD3+ 细胞为门控，第 5 天不同治疗后肿瘤中 CD8+ 和 CD4+ T 细胞的代表性流式细胞术分析；(g) 不同处理后巨噬细胞 M1/M2 比值；(h) 淋巴结成熟树突状细胞定量分析；(i) CD8+ T 细胞和 (j) CD4+ T 细胞在肿瘤中的定量百分比

研究小结：

综上所述，该研究开发了一种双酶驱动的级联反应平台（ILH），具备免疫抑制TME调控能力，用于PA成像引导的催化治疗。肿瘤内氧气生成与乳酸消耗的协同作用有效改善了免疫抑制TME，促使TAMs从M2型向M1型极化，从而激活抗肿瘤免疫。ILH显著缓解了肿瘤缺氧，并催化产生了大量氧化应激，最终诱导了ICD并激活抗肿瘤免疫。该方法在4T1异种移植模型中实现了90.1%的肿瘤抑制率（TGI）和92.1%的肺转移结节减少。含有Ir金属纳米酶的引入进一步增强了级联催化效率并实现了PA成像。通过3D多光谱PA成像监测内源分子信号的变化，实现了级联催化治疗过程的实时体内监控。该研究展示了一种用于分子影像导航、肿瘤催化治疗和免疫激活的纳米平台。