骨软骨是一种具有多层级结构的复杂组织，包括关节软骨和软骨下骨。具体来说，骨软骨组织自表面到底部可以分为表层软骨、弹性软骨和纤维软骨区。在这些不同的区域中，细胞外基质的组成、胶原纤维的排列方向以及组织的机械性能均呈现梯度变化。例如，羟基磷灰石（HAP）的含量沿梯度分布，关节表面的透明软骨几乎不含 HAP，而在弹性软骨和纤维软骨中其含量逐渐增多。随着骨软骨区域矿物含量的增加，其机械性能也相应增强。当前，骨软骨缺损修复的主要挑战在于如何模拟骨软骨区域的梯度结构，以实现理想的修复效果。

针对上述问题，浙江大学唐睿康教授团队发现，通过重力渗透法可以制备具有连续梯度结构的矿化水凝胶，用于骨软骨缺损的修复。该方法利用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）和透明质酸（HA）作为有机支架，构建了具有连续梯度矿物分布的水凝胶。PEGDMA是一种常见的水凝胶材料，因其优良的生物相容性和吸水能力广泛应用于组织工程和生物医学领域；此外，PEGDMA富含潜在活性官能团，能够为水凝胶提供理想的材料硬度，从而满足组织修复对力学性能的需求。透明质酸作为人体软骨和滑液中的天然成分，兼具良好的生物相容性，可补充软骨细胞外基质并为关节提供润滑和缓冲功能。其抗氧化特性还能中和自由基，降低氧化应激对细胞和组织的损害。在此研究中，通过引入光敏剂成功建立了HA/PEGDMA交联网络。随后，重力渗透法引入约2 nm的磷酸钙前驱体，使水凝胶呈现连续梯度的矿物含量和力学性能。这种基于重力渗透制备的矿化水凝胶材料，凭借其独特的连续梯度结构，为骨软骨缺损修复提供了新的有效途径。该文章于2024年09月02日以《Continuous-Gradient Mineralized Hydrogel Synthesized via Gravitational Osmosis for Osteochondral Defect Repair》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202408249）。

连续梯度矿化水凝胶的制备与应用示意图

（1）连续梯度矿化水凝胶的制备与表征以及HAP 物理性质和比例

在紫外光照射下形成了PEGDMA/HA交联水凝胶（简称pH水凝胶），作为有机框架，随后用于制备连续梯度矿化水凝胶。通过重力渗透法，在pH水凝胶中逐步引入不同浓度的约2 nm ACPC液滴，从而形成了连续梯度结构的pH@ACPC和pH@simi-ACPC水凝胶（图1a）。透射电子显微镜（TEM）图像显示，结晶HAP呈纳米棒状，长度约为100 nm（图1b）。pH@ACPC水凝胶的TEM图像展示了纳米棒状HAP晶体与不规则形状的有机成分，显示出ACPC在水凝胶内结晶为HAP的过程（图1d）。扫描电子显微镜（SEM）进一步确认了pH@ACPC水凝胶的表面结构，显示出水凝胶内顶部、中部和底部的三个界面区域：顶部的HAP晶体浓度较高，中间部分的浓度稍低，而底部几乎无HAP颗粒（图1e）。对pH@ACPC水凝胶中部区域进行的能量色散光谱（EDS）元素映射显示，C、O、Ca和P元素均匀分布，表明复合水凝胶制备的一致性良好（图1f）。利用微型计算机断层扫描（micro-CT）图像及其重建结果进一步表征水凝胶内HAP晶体的分布，验证了HAP在水凝胶中的连续梯度分布（图1g）。结果显示，在水凝胶底层约500μm厚度区域内无HAP分布，接近兔软骨的平均厚度。含有HAP的水凝胶表现出典型的黏弹性能，储能模量（G'）在整个频率范围内均高于损耗模量（G''）（图1j）。通过这种方法制备的矿化水凝胶表层的压缩模量为636 KPa，底层为1000 KPa，符合骨软骨部位的生物力学特性（图1m）。

图1 连续梯度矿化水凝胶的制备和表征。a）连续梯度矿化水凝胶的主要合成过程。B）完全矿化的HAP的TEM图像，显示纳米棒状HAP纳米颗粒。c）pH@ACP水凝胶的TEM图像，显示纳米棒状HAP纳米颗粒和有机组分。d）HAP的HR-TEM图像，显示HAP的晶格条纹。pH@ACPC水凝胶的SEM图像(e)和相应的EDS元素图谱(f)。g)pH @ ACPC水凝胶的CT图像，表明水凝胶中HAP的连续梯度分布。HAP和pH@ACPC水凝胶的XRD光谱。HAP、pH和pH@ACPC水凝胶的ATR-FTIR图谱。j–l)pH @ ACPC水凝胶的流变性质显示j)频率依赖性，k)应变依赖性，l)阶跃应变振荡剪切流变。m) pH@ACPC 水凝胶上部、中部和下部的压缩测试，显示 pH@ACPC 水凝胶内机械性能的梯度分布

（2）连续梯度矿化水凝胶诱导 MSCs 体外成骨分化

     与对照组相比，pH@semi-ACPC组和pH@ACPC组的碱性磷酸酶（ALP）表达分别显著上调了2.32倍和2.55倍（图2a）。在pH@semi-ACPC和pH@ACPC水凝胶中，COL1A1的表达均显著提高（图2b）。如图2c所示，pH@ACPC组的骨形态发生蛋白2（BMP2）表达量最高。骨桥蛋白（OPN）能够促进成骨细胞的迁移、粘附和成熟，调节其与其他细胞的相互作用，主要影响骨基质的形成和矿化。在水凝胶处理组中，与对照组相比，HAP的存在显著上调了OPN的表达（图2d）。使用两种类型HAP负载的水凝胶培养间充质干细胞（MSCs）后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到更强的红色荧光信号，表明两组中COL1A1蛋白表达增加（图2e）。此外，通过吸光度测量对ALP活性进行定量评估，间接反映了不同处理组的整体ALP活性，与RT-qPCR结果一致（图2h）。茜素红S（ARS）染色用于可视化和识别钙结节，其结果显示为红色沉积。结果表明，用两种连续梯度矿化水凝胶诱导MSCs两周后，细胞外基质中钙结节数量显著增加（图2i）。同时，通过溶解红色矿化沉积物的测定，两个连续梯度矿化组在405 nm的光学密度（OD）值更高（图2j）。

图2 连续梯度矿化水凝胶培养的 MSCs 的成骨分化。成骨培养 7 天后骨相关基因 ALP a)、COL1A1 b)、BMP2 c)、OCN d) 的 RT-qPCR 定量分析。e)不同水凝胶培养14天MSCs的细胞免疫荧光图像，显示COL1A1蛋白的表达。f)不同水凝胶诱导14天后MSCs成骨分化相关蛋白的WB结果。对照，pH、pH@semi-ACPC和pH@ACPC组孵育7天后ALP染色g)和定量统计h)。ARS染色I)和在405 nm处检测到的相关染色强度j)用于评估培养14天后对照组、pH组、pH @半ACPC组和pH@ACPC组中MSCs形成的钙沉积

（3）pH水凝胶能够在受损环境中通过抵抗活性氧（ROS）来保护软骨细胞的合成代谢表型

阿尔新蓝和甲苯胺蓝染色反映了软骨细胞细胞外基质的积累。此外，过氧化氢（H2O2）可以诱导氧化应激环境。染色结果表明，在存在ROS的情况下，pH组的软骨细胞的合成代谢能力基本得以保留（图3a，b）。聚集蛋白聚糖 (ACAN) 和 II 型胶原蛋白 (COL2) 是评估软骨细胞合成代谢最常用的生物标志物。RT-qPCR 分析的结果与染色的结果一致，表明暴露于 H₂O₂ 的软骨细胞中的 ACAN 和 COL2 的表达也可以通过纯 pH 水凝胶保留 (图 3c、d)。pH 水凝胶对软骨细胞合成代谢的保护作用可能通过减少 ROS 和炎症因子发挥。使用 ROS 荧光探针检测软骨细胞中的 ROS 水平。荧光信号强度表明，与仅受H₂O₂刺激的阳性对照组相比，两种 pH 水凝胶浓度组均能够降低 ROS 水平（图 3e）。使用流式细胞术定量分析细胞的荧光信号，发现水凝胶处理组和阳性对照组之间存在显著差异（图 3f、g）。流式细胞术结果显示，在 pH 水凝胶存在下，过氧化氢诱导的软骨细胞凋亡显着减少（图 3h、i）。细胞免疫荧光结果表明，使用浓度为 100 或 200 μg mL−1 的 pH 水凝胶可显著降低软骨细胞中的 TNF-α 表达（图 3j）。

图3 pH水凝胶对氧化应激下软骨细胞的保护作用。a、b)微团培养软骨细胞经阿尔新蓝和甲苯胺蓝染色，显示其具有分泌细胞外基质的能力。c、d)软骨细胞中合成代谢基因的RT-qPCR分析。e) 两种pH浓度下阴性对照组、阳性对照组、干预组软骨细胞ROS荧光图像。f) 不同处理下软骨细胞ROS流式细胞术检测结果。g)流式细胞术后定量测定四组ROS阳性软骨细胞的比例。h) 使用荧光染色的流式细胞术分析对凋亡的软骨细胞进行量化。i) 流式细胞术检测到的凋亡软骨细胞百分比，包括早期和晚期凋亡细胞。j) 软骨细胞 TNF-α表达的细胞免疫荧光图像

（4）连续梯度矿化水凝胶诱导体内骨软骨再生

使用micro-CT分析评估缺损区域的新骨形成情况。结果显示，6周后，对照组和pH组中仅有少量新骨组织生成；相比之下，pH@full-ACPC和pH@ACPC组出现显著的软骨下骨重建（图4a）。在水凝胶植入12周后，各组的修复程度有所差异，但pH@semiACPC、pH@full-ACPC和pH@ACPC组中再生骨的数量显著增加，表明这三种水凝胶具有较强的骨修复能力。通过骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）等关键指标，定量评估新生骨的空间结构和重建骨的质量。结果证实，pH@full-ACPC和pH@ACPC组的新骨形成明显优于对照组和pH@semi-ACPC组（图4b-g）。

采用苏木精-伊红（HE）染色评估再生组织的整体形态，以便观察软骨和软骨下骨的再生情况（图5a、f）。术后6周时，对照组和pH@semi-ACPC组仅显示极少的新软骨组织和软骨下骨形成；相反，pH@ACPC组的骨软骨缺损得到显著修复，与micro-CT分析结果一致。12周后，与对照组相比，水凝胶治疗组显示出广泛的骨组织修复。在关节软骨形成方面，pH@ACPC组的新生软骨结构连续完整，而其他组则表现为不规则且不完整的软骨层。pH@ACPC组表现出显著的软骨细胞外基质形成，反映了软骨修复效果的优势。

此外，采用免疫荧光染色法检测软骨组织中ACAN（图5d，i）和COL2（图5e，j）的表达。作为关键的软骨基质分泌蛋白，这两种标志物的表达在软骨形成中起到重要作用。植入水凝胶6周和12周后，水凝胶处理组中软骨细胞标志物的表达显著高于对照组，其中pH@full-ACPC组的免疫荧光信号较pH@ACPC组略低。总体结果表明，连续梯度矿化水凝胶在骨软骨缺损修复中显示出显著的效果，具备良好的临床应用前景。

图4 软骨下骨修复的Micro-CT图像及定量统计。a）从上到下四列图像分别为3D重建得到的micro-CT图像、两个角度的2D重建micro-CT图像以及修复后的软骨下骨组织的3D micro-CT重建。b–g）四组的BV/TV、Tb.Th和Tb.N表达，代表修复后的软骨下骨组织的定量统计结果

图5 不同组术后6周、12周再生组织的组织学和免疫荧光图像。a、f) HE染色。b,g) 番红-O/固绿染色。c,h) 甲苯胺蓝染色。d,i) ACAN 的免疫荧光染色图像。蓝色荧光信号表示细胞核，而绿色荧光信号表示 ACAN。e,j) COL2 的免疫荧光染色图像

研究小结：

该研究团队通过重力渗透法成功制备出具有连续梯度结构的矿化水凝胶，使其在结构上模拟了自然骨软骨的复杂层次，同时在功能上实现了对骨软骨缺损的精准修复调控。该材料的设计充分考虑了骨软骨单位的力学需求与生物学特性，使其在修复过程中能够为软骨层和软骨下骨层提供所需的特定微环境。这一仿生材料设计不仅为骨软骨缺损的修复提供了新的理论视角，也在实际应用中为开发更高效的生物材料开辟了新的方向。通过精确调控材料的成分和结构，这种材料能够更好地模拟骨软骨的自然特性，有望在未来的骨软骨修复领域发挥关键作用。