适应性T细胞疗法（ACT）是一种通过改造T细胞以表达肿瘤特异性受体（如T细胞受体TCR或嵌合抗原受体CAR）的免疫疗法，已在临床前和临床研究中展示出显著潜力。虽然在治疗B细胞恶性肿瘤方面取得了高达90%的完全缓解率，但对大多数实体瘤的疗效仍然有限。实体瘤的独特结构和特征构成了限制效应T细胞（Teff细胞）疗效的主要障碍。实体瘤周围的物理屏障会降低Teff细胞的浸润，如T细胞从内皮细胞外渗到肿瘤所需的粘附分子表达下调，以及细胞外基质的异常沉积导致的致密和纤维化环境，均限制了T细胞的迁移。此外，大量存在的免疫抑制细胞类型（如调节性T细胞Treg）会显著抑制Teff细胞，导致免疫耐受。因此，通过突破物理屏障促进Teff细胞浸润，同时调节肿瘤微环境（TME）以克服免疫抑制，有望增强T细胞疗法治疗实体瘤的效果。

针对上述问题，浙江大学顾臻、张宇琪、郭雨刚、俞计成团队开发了一种表面修饰了趋化因子CCL22的沟槽微针（MN）贴片，以促进TCR T细胞或CAR T细胞向实体瘤的局部渗透，并将Treg细胞从肿瘤微环境（TME）中分流，从而增强抗肿瘤疗效。该团队利用冰模板法制备了由聚苯乙烯组成的凹槽微针贴片，表面形成开放的凹槽，为T细胞的装载提供了足够的空间。插入肿瘤后，体温会触发T细胞从微针中释放，并浸润到实体瘤中。先前的研究表明，凋亡的Treg细胞能有效抑制T细胞的活化，甚至比活的Treg细胞更有效。该团队在微针上装饰了CCL22，以转移Treg细胞，而不是直接诱导其凋亡。作为趋化因子CCL22的受体，CCR4在Treg细胞中高表达，并调节其向TME的迁移。CCL22修饰的微针贴片能有效吸引Treg细胞，产生的CCL22梯度提高了CD8+ T细胞/Treg细胞的比例，从而增强抗肿瘤免疫力。这种由微针介导的T细胞免疫治疗局部策略有可能增强各种ACT疗法，并将其全身副作用降至最低。相关研究在2024年4月21日以“Grooved Microneedle Patch Augments Adoptive T Cell Therapy Against Solid Tumors via Diverting Regulatory T Cells”为题发表于《Advanced Materials》 （DOI: 10.1002/adma.202401667）上。

（1）凹槽微针贴片的示意设计图和表征

MNs由10%聚苯乙烯溶液（溶剂：对二甲苯）制成，采用冰模板法，通过冷冻铸造控制冰晶成核和生长，并通过固液相分离获得有序凹槽结构。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，这些纳米颗粒表面具有多个开放且排列有序的凹槽，有助于提高药物递送的有效性。随后，研究团队通过在表面聚合多巴胺来修饰MNs，提高其亲水性和可修饰性，有利于细胞负载和细胞因子修饰。水接触角测量结果显示，聚多巴胺修饰后MNs的润湿性显著增加。此外，微针贴片具有良好的组织穿透机械强度。免疫荧光成像显示，轻轻按压贴片即可使MN彻底破坏实体肿瘤的物理屏障。

图1 凹槽微针贴片的示意设计图和表征

（2）CCL22修饰的MNs介导Treg细胞迁移

研究人员使用体外Transwell迁移试验评估了CCL22修饰的微针（MNs-CCL22）对Treg细胞迁移的能力。流式细胞术（FACS）分析结果显示，经MNs-CCL22处理的活细胞中，Treg细胞（CD3+CD4+CD25+CD127-）数量在24小时后显著减少（1.15±0.26%），相比于未经修饰的MNs组（2.17±0.29%），而CD8+ T细胞数量差异不显著。MNs-CCL22组的Treg/CD8+ T细胞比例（4.76±0.51%）显著低于MNs组（11.53±1.74%），这对于增强抗肿瘤免疫力至关重要。在体内抗转移能力实验中，不同修饰比例的MNs-CCL22也显著抑制了肿瘤生长，进一步证明了通过募集Treg细胞所做的贡献。

图2 CCL22修饰的MN介导Treg细胞迁移

（3）T细胞的局部递送和控释

除了充当招募免疫抑制性Treg细胞的陷阱外，凹槽微针（MN）还可作为细胞递送装置，将T细胞局部输送到实体肿瘤中。为了进行体外研究，研究人员从OT-I转基因小鼠中分离出CD8+ T细胞，并通过在真空条件下将微针浸入高浓度T细胞的培养基中，将T细胞加载到微针中。此外，还研究了T细胞在37oC下的释放行为。结果表明，微针贴片可以有效地将T细胞局部送入实体瘤。聚多巴胺改性的微针提高了T细胞的装载效率，并通过热响应性明胶凝胶实现T细胞的控释。

图3 使用微针贴片进行T细胞的体内输送和分布

（4）凹槽MN贴片增强TCR T细胞治疗

为了验证上述微针（MNs）在TCR T细胞疗法中的抗肿瘤效果，研究人员利用小鼠黑色素瘤模型进行了体内实验。结果显示，裸露微针贴片治疗组的小鼠肿瘤生长与未治疗组相似，而MNs-CCL22或TCRT@MNs治疗组显示出中等抗肿瘤效果。当用TCRT@MNs-CCL22治疗时，肿瘤生长显著抑制，40%的小鼠存活至少60天，而未治疗组和MNs治疗组的小鼠无一存活。H&E染色图像显示，治疗组的细胞核收缩和减少，尤其在装载TCR T细胞的MNs-CCL22组中，MNs的变化可以忽略不计。TUNEL测定法进一步揭示该组中凋亡信号最多，TUNEL阳性细胞为95.17±0.25%，证实了凋亡介导的肿瘤细胞杀伤机制。免疫荧光结果表明，MNs-CCL22具有免疫调节作用，能够增强细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫力。

图4 微针介导的T细胞疗法在小鼠黑色素瘤模型中的治疗效果评价

（5）凹槽MN贴片增强CAR - T细胞治疗

研究人员还探索了微针贴片对CAR T细胞疗法的增强效果。通过使用靶向黑色素瘤相关抗原的CAR T细胞，研究人员发现，与未处理的对照组相比，经微针贴片处理的小鼠肿瘤生长得到了有效控制，生存时间延长。此外，微针贴片制剂进行局部治疗不仅能消除局部实体瘤，还能诱导全身抗肿瘤免疫记忆。

图5 微针治疗后Teff/Treg比例和抗肿瘤反应的分析

（6）Treg细胞转移介导的免疫治疗机制研究

为了证实Treg细胞转移在CAR-T细胞治疗增强中的关键作用，研究人员使用Treg细胞缺失的小鼠进一步评估了CAR T@MNs-CCL22微针的抗肿瘤功效。外周血样本的FACS分析结果显示，CD25抗体处理可诱导Treg耗损(CD3+CD4+CD25+ T细胞)为0.62±0.14%，而未处理的小鼠为7.94±1.14%。用CAR T@MNs和CAR T@MNs-CCL22制剂处理的小鼠具有相似的肿瘤生长特征和生存时间，进一步证实了用MNs-CCL22转移Treg细胞以增强ACT的重要性。此外，各组在治疗期间体重变化无显著差异。

图6 微针介导的CAR T细胞分散接种增强实体瘤的抗癌功效

小结：

针对T细胞浸润不足和免疫抑制微环境的问题，该团队设计了一种带凹槽的微针（MN）贴片，能够将T细胞局部输送到肿瘤部位，并选择性地将Treg细胞转移到微针上。与化疗或单克隆抗体治疗相比，这种带凹槽的MN贴片作为局部微环境，不仅能增强效应T细胞（Teff细胞）在实体瘤中的浸润，还能通过非凋亡途径消除Treg细胞。该装置的制备采用了基于相分离过程的冰模板法，形成垂直通道，用于细胞递送或细胞转运。此外，团队选择了模型趋化因子CCL22，通过温和的化学偶联锚定在微针上，以招募远离肿瘤微环境（TME）的Treg细胞，将微针贴片从体内取出即可清除TME中的Treg细胞。在小鼠黑色素瘤模型中，这些改良的MN贴片展示了在增强TCR T细胞和CAR T细胞疗法方面的治疗潜力。在小鼠体内清除Treg细胞后，虽然未提高CAR-T细胞疗法的效果，但这进一步证明了Treg细胞迁移可增强抗肿瘤效果。这种策略还可用于增强细胞或药物制剂的输送，以治疗各种疾病，如自身免疫性疾病。

原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202401667